Isothermal mRNA amplification on solid state?Xin chào cả nhà

**ttrndy** · #1 (**permalink**) 03-04-2011

Xin chào cả nhà

Mình đang muốn tìm một phương pháp dùng để phát hiện đột biến trên cancer cells. Mình dự định khuếch đại mRNA ở nhiệt độ cố định, trong một micro-reactor. Nhưng problem là các phương pháp mình biết như RCA, RAM không khuếch đại đặc trưng cho mutation giống như PCR truyền thống. Mình muốn thỉnh giáo cả nhà có ai biết phương pháp nào vừa khuếch đại mRNA, ở nhiệt độ không dổi, primer cố định trên solid surface không vậy?

Xin mọi người vui lòng gởi email tại: [Only registered and activated users can see links. ].

Hy vọng sẽ nhậ6n được sự giúp đỡ của mọi người

**ttrndy** · #2 (**permalink**) 03-06-2011

Co bac nao lam ve iso-thermal target mRNA amplification khong vao giup em phat

TheBigBangTheory · #3 (**permalink**) 05-01-2011

Anh ơi, dùng LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) đi.
Phương pháp này ko cần dùng máy PCR, chỉ cần bể ổn nhiệt 65 độ C trong vòng 45-60 phút là được.

Dùng Bst DNA Polymerase để amplify DNA. Có thể kết hợp luôn với Reverse Transcriptase luôn trong 1 reaction.

Nhược điểm: Thiết kế mồi phức tạp (4 different primers specifically designed to recognize 6 distinct regions on the target gene) + costly. Chỉ định tính, ko định lượng. (Nhưng do anh chỉ cần phát hiện thôi nên cũng ko cần định lượng làm gì.)

**ttrndy** · #4 (**permalink**) 05-10-2011

Hi Bạn

Thanks for advice!. LAMP tuy tốt nhưng thời gian amplify lâu và thiết kế primer rắc rối. Với lại mình cũng muốn định lượng nữa. Mình có chú ý đến NASBA -nucleic acid sequence-based aplification và Isothermalexponential ampliﬁcation reaction (EXPAR). Nhưng hiện tại vẫn chưa biết phương pháp nào tốt hơn.
Interested target của mình chọn là mRNA vì lương copies của nó trong cell nhiều hơn khi so sánh với DNA. Nếu chọn một dominant mutation thì mRNA +amplification sẽ có nhiều cơ hội phân tích được mutation ở mức độ đơn tế bào.

Nhưng mình vẫn chưa biết làm cách nào định lương được mRNA nếu dùng isothermal amplification?? bạn có idea gì về vấn đề này không?